原理:
結合重亞硫酸鹽的測序法是一種靈敏的能直接檢測分析基因組DNA甲基化模式的方法。重亞硫酸鹽處理后,用針對改變后的DNA序列設計特異性引物并進行聚合酶鏈式反應(PCR)。 PCR產物中原先非甲基化的胞嘧啶位點被胸腺嘧啶所替代,而甲基化的胞嘧啶位點保持不變。PCR產物克隆后進行測序。通過這個方法能得到特定位點在各個基因組DNA分子中的甲基化狀態。
特點:
1、特異性高,它能夠提供特異性很高的分析結果,這是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比擬的;
2、靈敏度高,可以用于分析少于100個細胞的檢測樣品。用微量的基因組DNA進行分析就能得到各個DNA分子精確的甲基化位點分布圖。
BSP流程圖
DNA用重亞硫酸鹽處理后進行PCR擴增,擴增片段純化后連接進載體,轉化大腸桿菌,過夜培養后挑單個陽性克隆進行測序。得到每個DNA分子特定區域甲基化位點的分布圖。
實驗流程:
1、DNA制備
用DNA抽提試劑盒(Promega, cat. No. A1125)抽提組織,細胞培養物,石蠟包埋組織切片樣品中的基因組DNA;
2、重亞硫酸鹽處理;
3、DNA純化
用試劑盒純化重亞硫酸鹽處理后的DNA樣品;
4、DNA脫磺基反應;
5、PCR擴增;
6、PCR產物瓊脂糖電泳后回收純化,隨后連接到pGEM-T EASY 載體中克隆及測序。
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