一般來說，腫瘤轉移在遠端器官間不是隨機分布的。腫瘤細胞的擴散主要有三種途徑：血行轉移、淋巴轉移和腹膜擴散。不同的腫瘤類型和亞型對轉移器官和途徑表現出不同的偏好。卵巢癌和胃腸道癌的一些亞型均表現為腹膜擴散；當癌細胞被動地從原發病灶釋放并植入腹膜時，就會發生。相比之下，大多數實體瘤通過血行和/或淋巴途徑進行主動轉移。臨床上，只有少數類型的實體腫瘤將淋巴管作為首選轉移途徑，包括：頭頸部鱗癌、食管癌、皮膚黑色素瘤和睪丸癌，而其他類型的腫瘤則有較高的通過血管轉移的傾向。研究表明，選擇特定轉移途徑的偏好可能受到幾個因素的影響，包括：特定器官的循環模式、癌細胞的固有特性、血管或器官特異性niche和宿主免疫微環境。最近一項基于超過25000名原發性和轉移性腫瘤患者的基因組測序研究顯示，在泛癌水平，沒有與器官特異性轉移相關的顯著基因組或通路改變。目前尚不清楚腫瘤細胞為何偏愛特定的轉移途徑。
鐵死亡是一種鐵依賴性的非凋亡調控的細胞死亡方式，在磷脂介導的膜損傷過程中，通過PUFAs的過度過氧化而發生。因此，從理論上講，調節細胞內外鐵含量、細胞膜脂質組成和氧化應激的基因會影響對鐵死亡的敏感性。細胞至少具有三種抗氧化系統來減輕脂質過氧化，包括眾所周知的GSH/GPX4軸、FSP1/輔酶Q10系統和新報道的BH4系統。調控氧化應激反應的轉錄因子也有助于鐵死亡，包括：驅動基因NFE2L2、轉錄因子BTB和BACH1。
鐵死亡已被發現可導致多種人類疾病，而鐵死亡在腫瘤發生中似乎是一把雙刃劍。根據最近的研究結果，淋巴似乎通過逃避鐵死亡來加強彌散性腫瘤細胞的生存能力，而血液則通過誘導鐵死亡來充當篩選轉移性腫瘤細胞的過濾器�；谶@種機制，淋巴轉移應該是主要的轉移途徑。然而，臨床上實體瘤最主要的轉移途徑是血行轉移。這就提出了一種可能性，即不同類型的腫瘤表現出不同的內在特征和對鐵死亡的敏感性，從而積極參與轉移路徑的選擇。
食管鱗狀細胞癌(ESCC)是全球致命的惡性腫瘤之一。盡管早期檢測、手術技術和放化療方法取得了進步，食管癌的預后仍然很差，5年生存率為15-25%。淋巴結轉移患者的預后往往比沒有轉移的患者差。轉移淋巴結的數量和比例已被證明是重要的預后因素。
研究路線
作者從FerrDB數據庫中選取經實驗驗證過的鐵死亡相關基因，并將其分為三類，包括：124個驅動基因、106個抑制基因和9個雙重作用基因。隨后，作者從TCGA下載了涵蓋17種常見癌癥的8247個樣本的轉錄組測序數據。除皮膚黑色素瘤(SKCM)外，其余類型腫瘤均有超過10個的癌旁組織樣本。SKCM數據集包括：368個轉移灶樣本和103個原發灶樣本。作者比較了SKCM轉移瘤與原發腫瘤之間的差異，而腫瘤與癌旁組織之間的差異將在其余類型腫瘤進行分析。作者提取了各類腫瘤中鐵死亡相關基因的表達數據，只保留差異表達基因進行進一步分析。
無監督聚類分析顯示，在優先淋巴轉移(淋巴結轉移為第一轉移途徑)的腫瘤，包括：黑色素瘤、食管癌(ESCA)和頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)中，鐵死亡相關基因的表達模式與非優先淋巴轉移的腫瘤不同。包括BACH1在內的一小組基因在三種以淋巴轉移為主的腫瘤中都過表達。血行轉移腫瘤之間存在顯著的異質性。部分腫瘤，如：腎癌、甲狀腺癌、前列腺癌，呈現鐵死亡抑制基因和驅動基因同時低表達的趨勢；而肝癌、子宮內膜癌、肺鱗癌等腫瘤，則呈現鐵死亡抑制基因和驅動基因同時高表達的趨勢。這些結果表明，不同的鐵死亡敏感性可能是腫瘤的內在特征，故而優先使用不同的轉移途徑。
2、在早期食管癌患者中篩查與淋巴結轉移相關的血清自身抗體
食管癌是一種偏好淋巴轉移途徑的典型腫瘤，這說明轉移細胞有更早、更大的機會接觸淋巴結內的免疫細胞而激活體液免疫。作者首先篩查了淋巴結發生轉移的早期食管癌患者的血清自身抗體。T1期食管癌患者(即腫瘤侵襲深度不超過粘膜下層)、不同淋巴結轉移狀態的患者和健康對照組的血清進行了HuProt蛋白質組芯片檢測，該芯片覆蓋了大約75%的人類蛋白質組。鑒別點的標準為：腫瘤組陽性率大于50%，腫瘤組最小信號值大于對照組中位數。腫瘤組與對照組、T1N0M0組與T1N1M0組之間平均信號值的差異倍數大于1.5的蛋白點均被認為是候選自身抗原。分析表明，分別有130、284個IgG自身抗體被鑒定為與食管癌、淋巴結轉移潛在相關的蛋白。此外，41種血清自身抗體在所有食管癌病例中均高表達，特別是在伴有淋巴結轉移的患者中。
3、BACH1的自身抗體在伴有淋巴結轉移的早期食管癌患者中被發現
將這兩個自身抗體差異數據集與鐵死亡相關基因列表進行比對，發現只有9個鐵死亡相關蛋白在食管癌中產生血清自身抗體。PPP1R13L、BACH1和SESN2在三個數據集中均有出現。作者隨后通過泛癌分析評估了這9個基因的表達特征。只有BACH1在優先淋巴轉移的腫瘤中顯著過表達，且在大多數非優先淋巴轉移的腫瘤中表達下調。
分析表明，BACH1血清自身抗體對食管癌淋巴結轉移的鑒別能力最高。在發現隊列中，BACH1血清自身抗體的敏感性和特異性均達到100%；其在健康個體中的熒光強度極低，在無淋巴結轉移的食管癌患者中的熒光強度較弱。然而，在淋巴結轉移患者中，其平均水平增加了4倍。這些結果表明，BACH1是淋巴轉移的特異性調控分子。
4、食管癌中BACH1自身抗體的獨立驗證
作者使用一個更大的獨立隊列，包含：122名健康對照、39名早期食管癌患者、50名無淋巴結轉移的食管癌患者和78名有淋巴結轉移的食管癌患者，通過免疫印跡法驗證了BACH1自身抗體。BACH1自身抗體在食管癌患者中的相對強度明顯高于健康對照組，早期食管癌患者與對照組差異尤其顯著。重要的是，有淋巴結轉移的患者的相對強度也明顯高于沒有淋巴結轉移的患者。以健康對照組的平均強度3為截斷值時，BACH1自身抗體陽性百分率在健康對照組為2.5% (3/122)，食管癌組為24.8%(30/128)，早期食管癌組為12.8%(5/39)，無淋巴結轉移食管癌組為12%(6/50)，有淋巴結轉移食管癌組為30.8%(24/78)。食管癌自身抗體水平與淋巴結轉移(P=0.0145)和AJCC分期(P= 0.0012)顯著相關；而與年齡、性別、組織學分級、腫瘤部位、腫瘤大小、T分期、M分期均無相關性。
通過受試者工作特征曲線分析評估了BACH1自身抗體識別食管癌、早期食管癌和伴淋巴結轉移食管癌的性能。曲線下面積(AUC)分別為：0.767、0.695和0.672；特異性為95%，敏感度分別為：32.8%、20.5%和14.1%。
5、BACH1在食管癌組織中的蛋白水平升高與淋巴結轉移有關
作者使用組織芯片進行了BACH1免疫組化染色試驗，研究了BACH1血清自身抗體水平升高是否對應食管癌腫瘤組織中抗原水平升高。結果表明，BACH1在癌旁組織和腫瘤組織中的陽性率分別為：9.7%(28/289)和31.5%(181/574)，表明BACH1在食管癌中顯著過表達。此外，與N0期腫瘤相比，BACH1在N1-3期腫瘤中的蛋白表達上調，這可能是BACH1血清自身抗體水平升高的潛在原因。另外，BACH1的高表達與食管癌的分化程度、AJCC分期以及預后不良均呈顯著正相關。陽性表達組和陰性表達組的中位總生存期分別為23個月和31個月。
6、BACH1可誘導食管癌細胞鐵死亡
作者首先在6個食管癌細胞系：KYSE150、KYSE170、KYSE180、KYSE30、KYSE410和KYSE510中檢測了BACH1、SLC7A11、GPX4和ACSL4的蛋白表達以及對鐵死亡誘導物RSL3的敏感性。結果顯示，BACH1的表達與RSL3對食管癌細胞的IC50值呈顯著負相關，而其他蛋白無顯著相關性。
接下來，作者構建了BACH1穩定表達敲除的KYSE170和KYSE150細胞系，以及BACH1過表達的KYSE150細胞系，并測定了RSL3對不同BACH1表達水平的KYSE150和KYSE170細胞的IC50值，結果表明，與野生型細胞相比，過表達(BACH1-OE))組的IC50值降低，穩定敲低(shBACH1)組的IC50值增加。C11-BODIPY591/581染色后的流式細胞分析顯示，與野生型細胞(1.8%)相比，BACH1-OE細胞的脂質ROS百分比增加到15.8%，而shBACH1細胞的脂質ROS百分比下降到1.1%。相差顯微鏡顯示，添加1μM RSL3后，BACH1-OE細胞變圓并漂浮，而對照組細胞無明顯變化。透射電鏡顯示，在1μM RSL3的作用下，BACH1-OE細胞線粒體數量減少，膜密度增大，嵴數量減少，這與鐵死亡的形態變化一致。這些發現表明，BACH1增加了食管癌細胞對鐵死亡的敏感性。
7、BACH1在食管癌體內促進淋巴結轉移，但抑制血行轉移
作者構建了足墊接種裸鼠模型，以評估BACH1在無胸腺裸鼠的淋巴結轉移中的體內作用。結果表明，BACH1的過表達增加了轉移淋巴結的大小、重量和陽性百分比(100%比25%)，而BACH1的穩定敲除則產生相反的效果。隨后，作者通過尾靜脈注射對照組或KYSE150-BACH1-OE細胞，研究了BACH1對血行轉移的影響，發現BACH1-OE細胞的肺轉移率顯著降低。
為了驗證鐵死亡對體內腫瘤生長和轉移的影響，作者首先給皮下異種移植瘤模型小鼠腹腔注射30mg/kg RSL3或10mg/kg Liprox-1 (鐵死亡抑制劑)，每2天注射一次，連續20天。結果表明，Liprox-1輕微促進腫瘤生長，而RSL3如預期所料沒有抑制作用。此外，作者用1μM RSL3預處理對照組和KYSE150-BACH1-OE細胞6小時，皮下成瘤實驗表明，BACH1-OE細胞的體內增殖和腫瘤重量顯著降低。接下來，作者使用足墊接種裸鼠模型，發現與對照組(DMSO)相比，腹腔注射RSL3顯著促進了腘窩淋巴結轉移(16.7%比83.3%)，而使用Liprox-1無明顯作用。這些結果表明，BACH1以依賴鐵死亡的方式促進了食管癌的淋巴結轉移，但抑制了食管癌的血行轉移，而鐵死亡本身抑制了皮下腫瘤的生長，同時促進了淋巴結轉移。
8、BACH1抑制MUFA的生物合成從而誘導鐵死亡
為了評估BACH1誘導的鐵死亡和淋巴結轉移的機制，作者對對照組和KYSE150-BACH1-OE細胞進行了轉錄組測序分析。KEGG富集分析顯示，除了鐵死亡外，差異表達基因在脂肪酸代謝相關途徑富集�；蚣患治鲞�顯示，BACH1的過表達負向調控了鐵死亡和SREBP信號通路。
脂肪酸的合成和代謝途徑已被報道與鐵死亡有關。因此，作者對KYSE150-BACH1-OE和對照細胞進行脂質組學分析。熱圖分析顯示，BACH1的過表達后細胞內脂質組成發生明顯變化。具體而言，BACH1的過表達導致含單不飽和脂肪酸(MUFA)磷脂的產量顯著下降，而PUFA磷脂(18:0/20:4)和磷脂酰乙醇胺(18:0/22:4)的產量有不同程度的增加，提示BACH1對食管癌細胞鐵死亡相關脂類的影響具有雙面性。此外，通過靶向脂質組學定量分析脂肪酸的變化，結果顯示，BACH1過表達后中鏈和長鏈脂肪酸顯著降低。值得注意的是，BACH1-OE細胞的OA顯著降低。OA是一種MUFA，通過減少膜中PUFA的數量或密度來抑制鐵死亡。因此，BACH1抑制了MUFA的合成，特別是OA，使食管癌細胞更容易發生鐵死亡。
9、OA在鐵死亡影響下在BACH1過表達的細胞中發揮趨化作用
隨后，作者對KYSE150和KYSE170細胞進行了功能恢復實驗。結果表明，添加400μM的OA幾乎全部逆轉了BACH1-OE引起的脂質活性氧(ROS)積累。在RSL3存在的情況下，OA的預處理使細胞活力顯著提高。此外，作者對傳統的Transwell實驗進行了改進，研究了OA在下室的趨化作用，并在上室中加入1μM的RSL3誘導鐵死亡。結果表明，與對照組相比，OA吸引BACH1-OE細胞并促進細胞遷移和侵襲。因此，OA的損耗是BACH1誘導的鐵死亡的主要效應，外源性OA誘導劑可以保護敏感細胞不受鐵死亡的影響。
10、BACH1通過負調控SCD1而抑制OA合成
為了深入研究BACH1抑制OA合成的機制，作者重新分析了轉錄組測序數據。與對照組相比，BACH1的穩定敲除和過表達分別產生516和56個差異表達基因，其中有10個共同基因。聚類分析顯示，兩組比較中只有SREBF1、SCD1、KRT17和CCDC80 4個基因表現出相反的趨勢。SCD1是催化飽和脂肪酸(主要是OA)轉化為MUFAs的速率限制酶，作者因而選擇SCD1進行下一步分析。隨后的western blot和qPCR檢測證實，BACH1負向調控SCD1的mRNA和蛋白水平。此外，作者評估了BACH1表達改變后，SLC7A11、GPX4和ACSL4的表達情況。與轉錄組測序數據一致，BACH1的過表達和敲除對這些基因的mRNA水平沒有產生相反的影響。但它們的蛋白表達水平與SCD1呈相似趨勢。因此，BACH1似乎沒有在轉錄水平調控這三種鐵死亡的調控因子，而BACH1誘導的鐵死亡伴隨著鐵死亡效應物SLC7A11和GPX4的下調。
然后，作者評估了SCD1與BACH1在臨床標本中表達的相關性，免疫組化染色檢測顯示，SCD1在鼻咽癌組織中顯著下調(n=295)。此外，BACH1與SCD1的蛋白表達水平呈負相關(P=0.0018，卡方檢驗)。
作者在KYSE150和KYSE170細胞中將SCD1表達敲除或過表達。SCD1的表達敲除顯著增加了兩種細胞系的脂質ROS積累，而過表達則略微降低了細胞內脂質ROS水平。在不同處理條件下，用熒光顯微鏡觀察細胞脂質ROS水平。與對照組相比，BACH1-OE組和siSCD1組的腫瘤細胞都顯示出更多的氧化脂質(綠色熒光)，而OA的添加顯著減弱了氧化表型。此外，作者還研究了OA在體內肺轉移中的作用。作者向KYSE150-BACH1-OE細胞注射OA作為預處理，與未進行OA預處理的組相比，其肺轉移灶的大小和數量明顯增加。這些結果共同證明，BACH1誘導的鐵死亡是通過抑制SCD1催化的OA合成而調控的。
11、BACH1在轉錄水平抑制SCD1的表達
為了進一步證實BACH1對SCD1的轉錄調控作用，作者首先利用JASPAR數據庫預測了BACH1在SCD1基因中可能的結合位點。預測結果表明，在啟動子區域沒有預測到結合位點，而在內含子2中有三個推測的位點。然后，作者設計了三個假定的結合位點的引物，并進行了ChIP-PCR檢測。結果表明，BACH1可以與SCD1基因內含子2的這些位點結合。此外，作者將來自SCD1內含子2的一個3kb插入片段(Chr10:100348450-100351450)和包含三個假設結合位點(SCD1-1和SCD1- 2)的兩個截頭(約700bp)構建成熒光素酶報告載體。與對照組相比，BACH1表達敲除細胞中的相對熒光素酶活性顯著增加，BACH1-OE細胞中相對熒光素酶活性被抑制。然而，BACH1的三個假定結合位點的突變導致其抑制SCD1報告基因轉錄的能力喪失。因此，這些發現表明，BACH1在食管癌細胞中通過與SCD1內含子區結合而在轉錄水平抑制SCD1。
研究結論
本研究中，作者發現實體瘤對鐵死亡的敏感性存在天然差異，高敏感性腫瘤細胞傾向于優先選擇淋巴轉移途徑。作者還發現BACH1血清自身抗體是檢測早期淋巴結轉移的有前景的生物標志物。在OA介導的腫瘤細胞趨化過程中，BACH1誘導的鐵死亡促進淋巴轉移，但通過新的BACH1-SCD1軸抑制血行轉移。這些發現突出了BACH1在轉移路徑選擇中的作用，闡明了鐵死亡通過促進腫瘤轉移而產生的不良反應，為鐵死亡相關藥物的臨床應用提供了參考。
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