肝內膽管癌(iCCA)是一種高度惡性腫瘤，預后較差。近年來，肝內膽管癌的全球發病率和死亡率均呈上升趨勢。由于缺乏疾病特異性的生物標志物用于肝內膽管癌的早期診斷，大多數肝內膽管癌患者確診時已經是晚期，可用的系統治療效果很差。因此，迫切需要鑒定新的腫瘤特異性生物標志物，作為可藥物靶點，以發現新的治療藥物，用于肝內膽管癌的個性化治療。
基因組和轉錄組測序在過去十年為肝內膽管癌的分子病因提供了有價值的視角。因此，一些結合FGFR2、IDH1或IDH2的分子抑制劑被開發用于治療攜帶FGFR2融合或IDH1/2突變的晚期肝內膽管癌患者。最近也有研究從蛋白質組學的角度為肝內膽管癌的分子發病機制提供了新的視角。然而，對不同組學數據集進行整合分析，從中揭示肝內膽管癌的共同特征和腫瘤特異性分子標志物的研究還很缺乏。
研究路線
TCGA、GEO或ArrayExpress數據集的差異分析顯示，有2696個共同異常表達基因。其中，1027個基因也在TCGA的肝細胞癌(HCC)數據集中異常表達，剩余的1669個基因被鑒定為潛在的肝內膽管癌特異性mRNA生物標志物。WGCNA分析顯示，這些潛在的腫瘤特異性生物標志物聚類于6個基因表達模塊中。在E-MTAB-6389隊列中，brown模塊(MEbrown)與肝內膽管癌的壞死檢出呈正相關，與患者的總生存時間呈負相關，故而是作者感興趣的模塊。對brown模塊中76個基因的聚類分析顯示，與非腫瘤肝組織樣本相比，除7個mRNA生物標志物：LRRC25、ZDHHC14、OVGP1、MRPS28、MTMR4、GRTP1和L2HGDH在肝內膽管癌中下調外，其余檢測到的mRNA生物標志物均顯著上調。
富集分析表明，所鑒定的mRNA生物標志物顯著富集于7個主要生物過程，包括：自然殺傷細胞介導的細胞毒性、氨基多糖分解代謝過程、脂肪酸衍生物生物合成過程、動物器官鑒定、硫酸軟骨素代謝過程、氨基糖代謝過程和生殖過程�；鹕綀D表明，COL12A1、IL8、CD248、ANTXR1和THBS2是brown模塊中表達上調最顯著的5個基因�？紤]到肝內膽管癌是一種富含膠原蛋白的惡性腫瘤，在brown模塊中鑒定的差異表達基因中，COL12A1的表達倍數變化排名第一。作者接下來研究并驗證了COL12A1在肝內膽管癌中的表達譜、臨床意義、上游調控機制和生物學作用。
2、COL12A1在肝內膽管癌臨床樣本中表達上調
對多個轉錄組數據集的整合分析顯示，相對于癌旁非腫瘤組織或肝癌組織，COL12A1在肝內膽管癌組織中的mRNA表達顯著上調。與組學數據一致，免疫印跡和RT-PCR實驗證實，COL12A1在肝內膽管癌組織標本中的mRNA和蛋白水平均顯著過表達。同時，與正常肝內膽管細胞相比，COL12A1在肝內膽管癌細胞中的mRNA和蛋白表達均上調。此外，在臨床肝癌組織和非腫瘤肝組織組織中，COL12A1的mRNA和蛋白表達相似；而COL12A1的蛋白表達在人肝癌細胞系中相對于正常肝細胞系HL7702下調。免疫組化和免疫熒光染色顯示，COL12A1蛋白在肝內膽管癌細胞質、細胞核以及細胞外基質中均有表達。
3、COL12A1在肝內膽管癌中表達上調且與不良臨床結果相關
COL12A1在TCGA、OEP001105或LVC1202隊列的晚期肝內膽管癌患者中的表達顯著增加。作者通過最佳截斷值：TCGA（11.375）、E-MTAB-6389（6.02）、OEP001105（5.255），將肝內膽管癌患者分為：COL12A1 mRNA高、低表達組。生存分析顯示，在TCGA、E-MTAB-6389或OEP001105隊列中，COL12A1 mRNA高表達的肝內膽管癌患者的預后明顯比COL12A1 mRNA低表達的肝內膽管癌患者差。對兩個獨立的肝內膽管癌隊列：OEP001105和LVC1202的分析表明，COL12A1蛋白水平表達上調對肝內膽管癌患者的預后有不利影響。在TCGA、OEP001105、E-MTAB-6389和LVC1202隊列中，COL12A1高表達的肝內膽管癌患者的中位總生存時間明顯短于COL12A1低表達的肝內膽管癌患者：18.55(10.16-29.54)個月比53.45(29.62-75.53)個月，p=0.014。同時，COL12A1高表達組患者的復發風險更高。此外，多因素分析表明，COL12A1的高表達是與肝內膽管癌患者預后不良相關的獨立風險因素。
4、COL12A1在肝內膽管癌和配對非腫瘤組織中的啟動子甲基化模式
為了研究COL12A1在肝內膽管癌中表達上調的上游機制，作者首先分析了兩個獨立的臨床肝內膽管癌的DNA甲基化數據集，確定了COL12A1啟動子和增強子區域的甲基化模式。在TCGA和GSE156299數據集中，COL12A1增強子區域的甲基化程度在肝內膽管癌組織和癌旁非腫瘤肝組織中相似；TCGA數據集中，COL12A1啟動子區域的甲基化程度在肝內膽管癌組織中明顯高于配對非腫瘤肝組織；而在GSE156299數據集中，COL12A1啟動子區域的甲基化程度在兩組間無顯著差異。此外，COL12A1的幾個位點：cg03564793、cg14375912、cg04074140和cg19132213，在肝內膽管癌組織中的甲基化程度與癌旁非腫瘤組織相比顯著升高，說明COL12A1啟動子的甲基化模式并不是其在肝內膽管癌中表達上調的原因。
5、MiR-424-5p在肝內膽管癌細胞中與COL12A1的mRNA直接結合
TargetScan數據庫(version 8.0)的預測分析表明，7個候選miRNAs：miR-424-5p、miR-15a-5p、miR-497-5p、miR-15b-5p、miR-6838-5p、miR-16-5p和miR-195-5p均可以與COL12A1的3'UTR區結合。配對和非配對分析均表明，相對于癌旁非腫瘤組織，miR-424-5p在肝內膽管癌中的表達顯著降低。除了miR-6838-5p在TCGA數據集中未檢測到外，其余候選miRNA在肝內膽管癌和癌旁非腫瘤組織之間表達水平相似。相關性分析顯示，在TCGA數據庫中，miR-424-5p與COL12A1 mRNA的表達呈顯著負相關。此外，與正常肝內膽管細胞HIBEpiC相比，miR-424-5p在人肝內膽管癌細胞中的表達顯著下調。
免疫印跡實驗表明，miR-424-5p的過表達可以抑制HuCCT1和RBE細胞中COL12A1的表達。熒光素酶報告實驗顯示，在共轉染miR-424-5p與COL12A1野生型3'UTR的HEK-293T細胞中，熒光素酶活性顯著降低；在共轉染miR-424-5p與COL12A1突變3'UTR的HEK-293T細胞中，熒光素酶活性顯著升高。RT-PCR結果顯示，miR-424-5p的過表達可下調HuCCT1和RBE細胞中COL12A1的mRNA表達。此外，作者通過內部肝內膽管癌數據集對miR-424-5p在肝內膽管癌中的下調以及COL12A1 mRNA與miR-424-5p表達的負相關進行了驗證。這些結果表明，miR-424-5p可以通過直接靶向COL12A1的mRNA而導致COL12A1的翻譯抑制或降解。
6、miR-424-5p啟動子區的高甲基化調控其在肝內膽管癌中的表達下調
為了確定miR-424-5p在肝內膽管癌中下調的上游調控機制，作者通過靶向亞硫酸氫鹽測序在10對肝內膽管癌樣本中檢測了miR-424的啟動子甲基化模式。結果顯示，與配對的非腫瘤組織相比，miR-424啟動子區CpG位點的甲基化程度在肝內膽管癌中顯著升高。在肝內膽管癌中，miR-424啟動子甲基化程度與miR-424-5p表達呈顯著負相關。此外，DNA甲基轉移酶(DNMTs)在轉錄水平上與miR-424家族成員呈表達負相關。這些結果表明，DNMTs介導的啟動子CpG位點高甲基化導致肝內膽管癌中miR-424-5p下調。
作者用地西他濱處理肝內膽管癌細胞，以評估DNA去甲基劑是否可以通過誘導miR-424啟動子去甲基化而抑制COL12A1的表達。免疫印跡檢測顯示，經地西他濱處理后，COL12A1在HuCCT1和CCLP1細胞中表達降低。靶向亞硫酸氫鹽測序顯示，在HuCCT1和CCLP1細胞中，miR-424啟動子區CpG位點的甲基化程度在地西他濱處理后降低。RT-PCR結果顯示，經地西他濱處理的HuCCT1和CCLP1細胞中，miR-424-5p的表達增加，而COL12A1 mRNA表達降低。此外，與對照組相比，COL12A1在地西他濱處理組的皮下異種移植瘤中的表達水平較低�？偟膩碚f，這些發現表明，DNMTs介導的miR-424-5p下調導致了肝內膽管癌細胞中COL12A1上調。
7、COL12A1促進肝內膽管癌細胞在體內外的增殖和生長
為了評估COL12A1對肝內膽管癌細胞進展的影響，作者使用COL12A1 CRISPR/Cas9 KO質粒分別在HuCCT1和RBE細胞中使COL12A1表達沉默。細胞活力測定結果顯示，COL12A1的表達敲除減弱了HuCCT1和RBE細胞的增殖。集落形成實驗表明，COL12A1的表達敲除通過減弱iCCA細胞的集落形成能力而抑制腫瘤細胞的生長。皮下異種移植模型實驗結果顯示，COL12A1的表達敲除抑制了腫瘤的生長和增殖。
8、COL12A1在肝內膽管癌中與上皮間充質轉化進程呈正相關
作者在E-MTAB-6389、TCGA和OEP001105數據集中進行了相關性分析，結果表明，COL12A1和EMT相關標記物：VIM一樣，均與EMT基因集顯著正相關。免疫印跡顯示，COL12A1的表達敲除可增加HuCCT1和RBE細胞中上皮標志物：E-cadherin的表達，而減少間充質標志物：N-cadherin和vimentin的表達。這些發現表明，COL12A1的上調在維持肝內膽管癌細胞的EMT進程中起著關鍵作用。
9、miR-424-5p在肝內膽管癌中海綿吸附COL12A1的治療價值
MiR-424-5p的過表達可抑制肝內膽管癌細胞的生長、侵襲和遷移。然而，miR-424-5p在體內是否具有抗腫瘤潛能尚不清楚。為了評估miR-424-5p在肝內膽管癌中的治療效果，作者通過尾靜脈給藥miR-424-5p激動劑(Ago-miR, 20 nmol /只小鼠)來治療荷瘤小鼠。在異種移植模型中，與對照組相比，AgomiR治療組的腫瘤生長明顯受到抑制。而且，與對照組相比，COL12A1在AgomiR治療組中的表達降低。
研究結論
作者的研究確定了COL12A1在肝內膽管癌進展中的關鍵作用。機制上，miR-424-5p在肝內膽管癌中由于其啟動子區CpG位點的高甲基化而表達下調；miR-424-5p可以直接與COL12A1 mRNA結合，故而miR-424-5p的下調有助于COL12A1的表達上調，從而促進了肝內膽管癌的進展。
作者提出，COL12A1是肝內膽管癌表觀遺傳治療的一個有前景的藥物靶點；miR-424-5p對COL12A1的靶向作用在肝內膽管癌中具有治療潛力。
欧美精品在线观看