結直腸癌(CRC)是最常見且致命的腫瘤類型之一，晚期并伴有轉移性疾病的患者死亡率特別高。結直腸癌的治療方法包括：手術、化療、放療和靶向治療等，化療是普遍采用的基石治療策略。目前，5-FU仍是治療結直腸癌最常用的化療藥物之一，其作用機制是不可逆地抑制胸腺苷合成酶，導致DNA合成受損。目前，對5-FU的治療耐受是結直腸癌患者獲得有效的系統化療治療的主要障礙。
上皮-間充質轉化(EMT)是細胞通過一系列保守機制擺脫上皮細胞特征而獲得間充質特征的過程。上皮細胞經EMT誘導后失去極性并從基底膜分離，從而獲得間充質樣特性，包括：遷移和侵襲能力的增強、腫瘤干細胞特征和凋亡耐受。多項研究表明，EMT與化療耐藥的出現有關。一系列重要的信號通路，包括：整合素/EGFR-ERK/MAPK、Wnt和Notch、TGF-β、ETAR、MMPs和缺氧等信號通路調控EMT的誘導和進展。
雙特異性酪氨酸磷酸化調節激酶2 (DYRK2)是DNA損傷修復、細胞周期進展和凋亡性細胞死亡的重要調節因子。多項研究表明，DYRK2可以調控多種腫瘤的EMT誘導。最近的生物信息學分析表明，DYRK2是在結直腸癌中唯一發現的顯著下調的激酶。此外，也有證據表明，DYRK2的表達下調與肝轉移和患者預后密切相關。然而，目前尚不清楚DYRK2是否參與了結直腸癌化療耐藥的調控，從而影響結直腸癌患者的器官轉移和預后。
研究路線
作者通過TIMER數據庫初步分析了DYRK2在不同腫瘤中的mRNA表達，分析表明，DYRK2在13種腫瘤中表達上調，在3種腫瘤中表達下調（含結直腸癌）。TCGA數據庫的進一步分析顯示，相對于鄰近正常組織，DYRK2在結直腸癌腫瘤組織中的表達水平顯著下調。作者進而使用結直腸癌組織芯片，采用免疫組化(IHC)研究了DYRK2的表達與患者的臨床病理特征的相關性。結果顯示，DYRK2在65.06%(54/83)的樣本中表達水平較低，而與癌旁組織相比，DYRK2僅在34.94%(29/83)的樣本中表達水平較低。在這些結直腸癌組織樣本中，高級腫瘤分化與DYRK2的表達下調有關。
為了進一步探討觀察到的DYRK2表達變化的臨床意義，作者接下來對DYRK2的表達與結直腸癌患者的臨床病理特征進行了相關性分析。分析表明，DYRK2的表達與結直腸癌患者的淋巴結轉移、肝轉移和病理分級有關。此外，在54例DYRK2低水平表達的患者中，21例發生了肝轉移。在該患者隊列中，DYRK2的表達水平與無病生存期(DFS)和總生存期(OS)之間存在顯著相關性。因此，這些數據指出，DYRK2是與結直腸癌患者臨床結果相關的預后指標。
2、DYRK2的表達下調與5-FUR LoVo細胞的惡性程度有關
作者進一步檢測了DYRK2在不同結直腸細胞系和5-FU耐藥細胞(5-FUR)中的表達情況。結果表明，與親本細胞：LoVo、HCT116、SW480和HCT15相比，DYRK2在LoVo 5-FUR、HCT116 5-FUR和SW480 5-FUR細胞系中的mRNA和蛋白水平均表達下調。然而，DYRK2在HCT15和HCT15 5-FUR細胞間的表達沒有差異。與親本LoVo細胞相比，DYRK2在LoVo 5-FUR中的表達顯著降低。接下來，作者探討了DYRK2作為5-FUR LoVo細胞惡性行為調節因子的潛在作用。CCK-8檢測表明，5-FUR LoVo的細胞活力較親本細胞系增強。5-FU對LoVo和5-FUR LoVo細胞的半抑制濃度(IC50)分別為：4.011 μg/mL和9.608 μg/mL，與后者對5-FU抗性的增加相一致。流式細胞術分析進一步顯示，5-FUR LoVo細胞的凋亡率降低，而Transwell分析顯示，與親本細胞相比，它們的遷移和侵襲活性增強�？傊�，這些數據表明，DYRK2的表達下調與5-FUR LoVo細胞的惡性程度增強有關。
3、DYRK2的表達下調與上皮-間充質表型轉化有關
形態學分析顯示，與親本LoVo細胞觀察到的間充質表型不同，5-FUR LoVo細胞的形態特征發生了明顯的變化，其形態呈梭形、不規則、分散。為了驗證這些結果，作者對EMT標記蛋白：Vimentin和E-cadherin進行了免疫熒光染色。結果表明，上皮標志物：E-cadherin在親代細胞中的表達高于5-FUR LoVo細胞；間充質標志物：Vimentin在親本LoVo細胞中的表達低于5-FUR LoVo細胞。Western blotting進一步證實了這些結果。因此，這些數據表明，EMT誘導與長時間暴露于5-FU后獲得性化療耐藥有關。
4、DYRK2的過表達抑制了5-FUR LoVo細胞的5-FU抗性、增殖、遷移、侵襲和凋亡抗性
為了直接檢測DYRK2調控5-FUR LoVo細胞惡性的能力，作者接下來將DYRK2過表達的慢病毒載體或空白對照載體轉染入這些細胞中，qPCR和Western blotting證實，DYRK2在這些細胞中成功過表達。CCK-8檢測表明，DYRK2的過表達與細胞活力受損有關。此外，DYRK2的過表達顯著提高了24 小時內細胞對5-FU處理的敏感性，LoVo 5-FUR NC、LoVo 5-FUR Vector和LoVo 5-FUR DYRK2的IC50分別為：10.280 μg/mL、9.557 μg/mL和3.863 μg/mL。Transwell實驗表明，DYRK2的過表達還會誘導細胞的凋亡性死亡，同時損害它們的遷移和侵襲能力。這些結果與DYRK2在結直腸癌中的抑癌基因功能一致。
5、DYRK2的過表達可恢復5-FUR LoVo細胞的上皮表型
如下圖所示，免疫熒光染色檢測了E-cadherin和Vimentin在這些細胞中的表達。Western blotting結果顯示，DYRK2的過表達導致EMT誘導功能受損，Vimentin下調，E-cadherin上調。
6、Twist是DYRK2在結直腸癌中的下游靶基因
為了進一步探究DYRK2與結直腸癌細胞中EMT誘導之間的機制聯系，作者檢測了DYRK2表達上調后，Twist、ZEB1和Snail的表達水平。結果表明，Snail和ZEB1在三組間無顯著性差異表達，而Twist在LoVo5-FUR NC組和LoVo5-FUR Vector組高表達，在LoVo5-FUR DYRK2組表達水平相對較低。
在DYRK2過表達后，Twist在5-FUR LoVo細胞中的蛋白水平降低，因此，Twist可能是DYRK2的底物。為了測試DYRK2調控Twist泛素化的能力，作者將Twist與泛素共孵育，發現DYRK2促進了Twist的泛素修飾。接下來，作者將蛋白酶體抑制劑：MG132添加到細胞裂解液中，進一步確認調控Twist降解的機制。結果顯示，在DYRK2存在時，Twist的蛋白水平迅速下降，而在加入MG132處理后，這些水平趨于穩定。這些數據表明，DYRK2可以與Twist相互作用，從而促進其蛋白酶體降解。
7、DYRK2的過表達抑制了體內Twist的表達和結直腸癌異種移植瘤的生長
接下來，作者進行了動物模型實驗，結果顯示，DYRK2的過表達可以顯著降低腫瘤體積和重量，抑制腫瘤生長。治療3周后，對小鼠實施安樂死，并計算腫瘤抑制率，結果顯示，5-FUR LoVo組的腫瘤生長速度明顯快于LoVo組(p=0.024)，證實了在體外所觀察到的這些化療耐受細胞的惡性程度增強。5-FUR LoVo組的裸鼠經5-FU處理后，腫瘤生長減慢，腫瘤抑制率為41.39%。5-FUR LoVo vector/5-FU組的抑制率為46.16%，而5-FUR LoVo DYRK2/5-FU組的抑制率顯著提高至64.32% (p=0.027)。這些結果證實，DYRK2能夠顯著增強5-FUR LoVo細胞的化療敏感性。
相對于LoVo組，在5-FUR LoVo組的腫瘤中，DYRK2的表達水平較低，Twist的表達水平較高，并伴有E-cadherin的表達降低和Vimentin的表達增加，這與這些耐藥腫瘤中所發生的EMT誘導一致。相對于5-FUR LoVo/5-FU組，DYRK2過表達的5-FUR LoVo組經5-FU處理后，DYRK2上調，Twist下調；E-cadherin上調，Vimentin下調（EMT誘導被抑制）。這些結果提示，DYRK2可能通過靶向Twist而抑制5-FUR LoVo細胞的EMT，從而調節腫瘤生長和化療耐藥。IHC染色進一步證實，與5-FUR LoVo/5-FU組相比，5-FUR LoVo DYRK2/5-FU組的異種移植瘤中，DYRK2和E-Cadherin蛋白水平顯著升高�？傊�，這些數據證實了，DYRK2可以通過抑制Twist的表達調控腫瘤的生長和EMT的誘導。
8、DYRK2和Twist表達的組合在結直腸癌患者中具有預后效用
為了進一步驗證DYRK2在結直腸癌病例中與Twist表達的相關性，作者檢測了Twist在結直腸癌組織芯片樣本中的表達情況。分析表明，Twist在結直腸癌樣本中的表達顯著增加，而DYRK2的表達較低。統計分析顯示，Twist在結直腸癌組織中的表達與DYRK2呈負相關。此外，配對分析表明，DYRK2高表達且Twist低表達的患者的總生存期和無病生存期明顯長于DYRK2低表達且Twist高表達的患者。這些結果表明，DYRK2與Twist的聯合檢測可作為結直腸癌患者臨床預后的預測工具。
研究結論
本研究表明，DYRK2是結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移的重要調節因子。DYRK2通過抑制Twist的表達，從而調節腫瘤細胞的EMT誘導、化療敏感性和凋亡。此外，DYRK2可以作為結直腸癌患者的預后生物標志物，是該類癌癥的一個新的有前景的治療靶點。
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