2、BTN3A1作為原癌基因在體內外促進ESCC的生存

BTN3A1的研究主要集中在其與pAgs的結合和向Vγ9Vδ2 T細胞呈遞，但尚未有關于其在ESCC中相關作用的報道。作者采用WB和RT-PCR方法，在ESCC細胞系：KYSE150、KYSE510、ECA109、KYSE140和TE-1，以及正常食管鱗狀細胞系：HET-1A中檢測了BTN3A1表達。結果表明，BTN3A1在ESCC細胞系中的表達高于正常細胞系。此外，作者還檢測了BTN3A1在細胞中的定位。免疫熒光(IF)染色顯示，BTN3A1主要定位于ESCC細胞的細胞質中，只有少數分布在細胞表面。作者構建了BTN3A1表達上調或下調的KYSE150和ECA109細胞系。CCK-8檢測顯示，BTN3A1的過表達促進細胞增殖，而BTN3A1的表達下調則阻礙細胞增殖。EdU染色顯示，BTN3A1過表達細胞的DNA復制率較高。接下來，集落形成實驗結果顯示，BTN3A1的過表達加速了細胞集落形成。作者還進行了傷口愈合試驗和transwell遷移試驗，用以評估細胞的活力。結果顯示，BTN3A1的過表達增強了腫瘤細胞的惡性程度。動物模型的結果表明，BTN3A1促進異種移植瘤生長，表現為腫瘤體積增大和腫瘤重量增加。這與細胞系的結果一致。

3、BTN3A1的表達敲除可使體內外的ESCC細胞對放療敏感

作者接下來研究了BTN3A1的表達與放療之間的關系。研究表明，放療對BTN3A1的蛋白表達水平有正向影響，并增加了p-ATM和γ-H2AX的表達。此外，作者檢測了BTN3A1表達的時間依賴性效應，發現BTN3A1的表達增加呈放療時間依賴性。BTN3A1的表達在放療6小時后開始增加。BTN3A1、p-ATM和γ-H2AX蛋白表達的統計分析如下圖所示。作者進一步檢測了γ-H2AX在放療后的BTN3A1-KD和BTN3A1-OE細胞中的水平。WB分析表明，BTN3A1的表達敲除使ESCC細胞對放療誘導的DNA損傷呈時間依賴性，而BTN3A1過表達使ESCC細胞對放療誘導的DNA損傷不敏感。同時，IF染色顯示，γ-H2AX灶在BTN3A1-KD細胞中數量明顯增加。集落形成實驗表明，BTN3A1的表達敲除的KYSE150和ECA109細胞的克隆潛能在放療后顯著降低。與上述結果一致，CCK-8試驗顯示，BTN3A1表達敲除的細胞的存活率低于對照細胞。EdU染色顯示，BTN3A1的表達敲除可導致ESCC細胞對放療敏感。接下來，作者構建了BTN3A1質粒(shMT，同義突變)并轉染入KYSE150細胞，以恢復BTN3A1在表達敲除后的表達。結果表明，BTN3A1在敲除細胞中的表達恢復，同時，放療耐受也得以恢復。

作者使用BTN3A1穩定敲除的KYSE150細胞系構建了小鼠異種移植瘤模型，并對特定的腫瘤區域放療，以驗證BTN3A1的表達敲除是否使ESCC細胞在體內對放療敏感。與非放療組相比，放療中度抑制了對照組的腫瘤生長(p<0.01)，顯著抑制了BTN3A1表達敲除組的腫瘤生長(p<0.001)。接受放療和BTN3A1敲除兩種處理的小鼠體重增加，腫瘤生長較慢(p<0.001)�；�于以上結果，作者認為，BTN3A1的表達敲除可使ESCC細胞對放療敏感，BTN3A1抑制劑可作為提高ESCC患者放療療效的藥物而被開發。

4、BTN3A1的表達敲除降低了ESCC細胞的自噬水平

作者使用PCR芯片研究了與BTN3A1作用相關的死亡模式。shBTN3A1組與對照組相比較，共鑒定出35個顯著差異表達的基因。在所有與特定細胞死亡模式相關的基因中，ULK1的相關性最高。此外，作者還用WB檢測了與自噬、凋亡和焦亡相關的蛋白的表達。結果表明，與對照細胞相比，ULK1和MAP1LC3B/LC3B在BTN3A1表達敲除的細胞中的表達降低。接下來，作者研究了BTN3A1在放療介導的自噬中的潛在作用。放療（8Gy）后，與對照細胞相比，ULK1和LC3BII/LC3BI在BTN3A1表達敲除的細胞中的表達降低，p62/SQSTM1的表達增加。通過將mRFP-GFP-LC3慢病毒載體轉染入KYSE150細胞，作者研究了BTN3A1對自噬體(黃色斑點)和自溶酶體(紅色斑點)形成的影響。數據顯示，BTN3A1的表達降低逆轉了ESCC細胞中放療所激活的自噬通量。作者通過透射電鏡觀察了KYSE150細胞的超微結構，每個切片隨機選取12個細胞并對自噬液泡(AVs)進行計數。與對照細胞相比，BTN3A1的表達缺失顯著減少了放療細胞中的AVs數量(p<0.001)。BafA1是一種已知的自噬后期的抑制劑，可阻止p62的降解，作者用其來確定BTN3A1是否調控自噬體的形成或自噬通量。結果表明，BTN3A1增加了KYSE150細胞中LC3B-I向LC3B-II的轉化和mRFP-GFP-LC3 puncta的積累；而BafA1通過阻斷LC3BII的降解和自噬通量而抑制BTN3A1的功能。綜上所述，這些結果表明，BTN3A1參與了自噬過程，其在ESCC細胞中的表達敲除降低了放療誘導的自噬水平。

5、BTN3A1通過激活自噬而促進細胞的放療耐受

越來越多的證據表明，自噬有助于癌細胞的放療耐受。本研究中，作者發現3-MA(一種自噬抑制劑)的處理增強了ESCC細胞對放療的敏感性；而通過誘導饑餓(使用EBSS)則增加了自噬水平，ESCC細胞的放療耐受能力也明顯增強。作者通過集落形成來確定BTN3A1是否通過自噬途徑調節ESCC中的放療耐受。結果表明，經EBSS處理的KYSE150細胞對放療的敏感性低于對照組細胞；而將BTN3A1特異性shRNA的慢病毒轉染入EBSS處理的細胞后，放療敏感性有一定程度的提高，而對照組則無差異。轉染BTN3A1質粒的KYSE150細胞比對照細胞對放療更加耐受, 而3-MA的處理可以使細胞對放療再次敏感。CCK-8測定也獲得了一致的結果。作者的結果表明，BTN3A1的表達敲除所誘導的放療致敏至少部分是由于自噬水平的降低而造成的。

隨后，作者研究了ESCC樣本中BTN3A1表達與自噬之間的關系。免疫組化染色顯示，LC3B在腫瘤組織中的蛋白表達與BTN3A1的表達呈正相關(r=0.867, p<0.001)。此外，放療增加了LC3B的表達，但這種改變隨著移植瘤中BTN3A1的下調而減弱。

6、BTN3A1激發了ULK1介導的自噬

為了研究BTN3A1參與自噬的機制，作者分析了TCGA數據庫中的基因表達譜數據。分析表明，BTN3A1與自噬相關基因：ULK1、CASP8、CFLAR、TNFSF10和ATG4C的表達顯著相關(p<0.001)。同時，作者也從GEO數據庫中選擇了獨立的ESCC病例隊列(50例，GSE161533、GSE20347和GSE17351)進行分析。結合TCGA數據庫和GEO數據庫的分析結果，作者推測BTN3A1的表達與ULK1的表達相關。IF染色顯示，BTN3A1和ULK1在ESCC細胞中共定位。隨后，作者在KYSE150細胞中進行免疫共沉淀(Co-IP)實驗，并通過質譜分析特異性抗體所下拉的蛋白。結果表明，只有BTN3A1組可以檢測到ULK1。在KYSE150細胞和ECA109細胞中，Co-IP也證實了BTN3A1與ULK1相互作用。BTN3A1介導的自噬可能與ULK1基因有關。研究表明，ULK1被多個上游激酶，如：mTOR和AMPK在不同的位點磷酸化，并影響其激酶活性。在本研究中，BTN3A1的過表達調節ULK1的表達，促進其Ser555位點的磷酸化。此外，BTN3A1的表達敲除抑制了KYSE150和ECA109細胞中ULK1 Ser555位點的磷酸化。作者通過WB研究了BTN3A1對ULK1通路的影響。1 μM MRT68921的處理抑制了ULK1活性，減少了BTN3A1的過表達所引起的自噬。這些結果表明，BTN3A1通過提高ULK1活性而誘導自噬；此外，ULK1激動劑(LYN-1604)可恢復BTN3A1的表達下調對自噬的抑制作用。

7、放療通過HIF-1α介導的過程而增加BTN3A1的表達

放療后，腫瘤的氧合趨于增加。文獻表明，HIF-1α是信號轉導的來源和腫瘤放療敏感性的一個主要決定因素；輻射暴露可以誘導胰腺癌和肺癌中HIF-1α蛋白的表達。在本研究中，初步結果表明，放療增加了BTN3A1和HIF-1α的表達；在細胞中加入2.5 μM 2-ME(HIF-1α抑制劑)，放療誘導的BTN3A1過表達被抑制。將HIF-1α shRNA轉染入KYSE150和ECA109細胞，進一步證實了HIF-1α參與了放療介導的BTN3A1表達。這些結果表明，放療可能通過HIF-1α依賴的方式激活BTN3A1。IF染色顯示，2-ME的處理導致BTN3A1和HIF-1α的表達水平明顯低于對照組。作者也檢測了BTN3A1敲低細胞中的HIF-1α表達。結果表明，BTN3A1的表達不影響HIF-1α的表達；BTN3A1可能是HIF-1α的下游基因。

為了研究BTN3A1是否是HIF-1α的直接靶基因，作者首先通過ChIP-qPCR方法驗證了Jaspar和hTF target預測的HIF-1α在BTN3A1啟動子中的五個潛在結合位點。ChIP分析顯示，BTN3A1(HRE-1)和BTN3A1(HRE-4)啟動子區結合的HIF-1α顯著增加。為了進一步確定HIF-1α是否與BTN3A1基因組序列相互作用，作者將pM14空載體和pM14 HIF-1α載體、pL01 BTN3A1-hRluc/SV40， 或pL01 BTN3A1-hRluc/SV40 MUT載體共轉染入KYSE150細胞。結果表明，BTN3A1報告基因熒光素酶活性在轉染入HIF-1α載體的細胞中比未轉染HIF-1α載體的細胞高兩倍多�；�于這些結果，作者認為BTN3A1是HIF-1α的直接靶基因，放療可能通過增加HIF-1α表達水平而上調BTN3A1的表達。

研究結論

本研究，作者首次發現BTN3A1在ESCC組織中高表達；BTN3A1的高表達與淋巴結轉移和腫瘤浸潤正相關，BTN3A1表達上調是預測ESCC患者預后不良的獨立因素。此外，作者首次報道了BTN3A1的表達與放療耐受相關。機制上，放療通過增加HIF-1α表達水平而上調BTN3A1的表達；BTN3A1進而調控ULK1的表達并促進其Ser555位點的磷酸化從而誘導自噬。

本研究指出，靶向BTN3A1可能是提高ESCC患者放療療效的一種有前途的策略。